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高速逆流色谱

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高速逆流色谱仪

      目前技术成熟并且应用广泛的高速逆流色谱仪为J型螺旋管行星式高速逆流色谱仪利用充满流动溶剂的螺旋管作为分离单元(即螺旋管分离柱,coils),在电机的驱动下围绕主轴进行公转的同时,做同步同向的行星式自转;在这种规律变化的离心力场作用下,流过螺旋管的互不相溶的两相溶液形成单向性的两相分布;并依其界面特征形成极微小的颗粒。当被分离的混合物通过分离单元时,样品中各组分会在两相微粒的交界表面上充分分配,并且能在颗粒振荡与对流的环境中于两相间有效地传递。离心旋转一周,这种分配过程就进行一个循环,因此每分钟上千转的离心转速就意味着普通的溶剂萃取过程被成千上万次地、高效地、自动连续地完成。不同的溶质分子将按照其在两相溶剂中分配系数的大小被顺序洗脱而实现分离。

技术原理

J型螺旋管行星式高速逆流色谱仪分离柱在离心旋转的各位置中的受力分析及分离柱中液体上下相溶剂的分布示意图。

 • 采用旋转密封方式突破高速逆流色谱仪的工业化放大瓶颈:


    传统高速逆流色谱仪都是采用解绕管+解绕轴方式解决液体流通管路做行星式旋转的打结问题,机械结构复杂并且管路在机械转动作用下,很容易渗漏甚至断裂,一直是高速逆流色谱仪放大瓶颈。我们采用旋转密封技术,有效解决长期以来高速逆流色谱仪的管路渗漏和断裂问题,提高仪器分离转速和旋转离心重力场,彻底解决了工业制备规模高速逆流色谱仪的工作效率和稳定性问题。

分离专家们对传统高速逆流色谱仪器的疑虑:

可见,固定相保留率是影响分离效率的一个主要因素。固定相保留率是分离柱中保留的固定相体积与分离柱体积之比:

其中,Vs为分离柱中固定相的体积,Vc为分离柱体积,Vf为系统死体积,Ve为体系平衡后推出的固定相体积。

离心重力场(g-force field--J型行星式螺旋管高速逆流色谱仪分离效率提高的关键参数


  决定高速逆流色谱仪分离效果的因素有很多,包括样品因素,溶剂体系性质,分离参数设置,以及仪器本身性能因素。在样品与溶剂体系因素固定时,离心重力场越大,固定相保留率就越高。(S. Ignatova et al., Journal of Chromatography A, 1151:20H. Guzlek et al., Journal of Chromatography A, 1216:4181

      其中Z是与溶剂系统上下相的粘度和密度差、以及分离柱管径等因素相关的一个常数。F为流速,R为公转半径,w为转速。可见,流速与离心重力场之比值决定了固定相保留率的大小;换言之,如果高速逆流色谱仪的离心重力场与分离流速同比例增高,就能够维持固定相保留率的恒定。很容易理解的是,分离柱中的固定相是依靠螺旋管高速旋转而形成的离心重力场被保留在分离柱中,因此离心力量越大,保留的固定相越多。而增加的固定相保留又对分离效率的提高起了主要推动作用,如分辨率和理论塔板数。


  影响高速逆流色谱仪的理论塔板数的因素也非常复杂,在柱型设计(包括管径、管长、b值)一定的条件下,理论塔板数决定于流动相穿越固定相的次数和每次的溶质转移(mass transfer rate)。溶质转移效率越高,色谱峰越尖锐,理论塔板数越高。


  离心转速的提高,增加了流动相与固定相的混合频率,使两相混合所形成的液滴更细碎,从而增加了两相间界面面积(interfacial area,提高溶质转移效率。


  此外,在J型螺旋管行星式高速逆流色谱仪中,螺旋管分离柱的每个点在旋转的每一周经历由远心端到近心端再回到远心端的一个循环。每个循环是一个固定相与流动相之间混合-分离的过程。增加的离心转速意味着在特定时间范围内,混合-分离频率的增加,也就意味着溶质在固定相和流动相之间穿梭频率的提高。尽管增加的频率缩短了每次混合的时间,有降低溶质转移的因素,但是如果同时提高流动相的流速,就能够补偿穿越固定相的流动相的流量,而保持溶质转移效率。高离心重力场为流速的增加提供了可能,保证了高流速条件下的固定相保留率。因此,高离心重力场能增加溶质转移效率,从而提高理论塔板数。


•离心重力场的提高意味着:


    • 固定相保留率


    • 理论塔板数,溶质分辨率


    • 分离柱样品负载量


    • 保持固定相保留率的前提下,流速


    • 分离时间


    • 单位时间内样品通量

• 高速逆流色谱仪的离心重力场计算:


   高速逆流色谱仪的公转半径和离心转速决定了该仪器的其离心重力场大小:


    RCF = 1.119*R*(RPM/1000)2


    RCF 为离心重力场(相对离心力), R为公转半径,即分离柱的自转轴与公转主轴之间的距离(mm为单位),ω为公转角速度(rpm,转/分钟)。

 • 高速逆流色谱的分离模式充分应用固定相的液体特征

   高速逆流色谱是以液体为固定相的液液分配色谱技术,而固定相的液体特征赋予了高速逆流色谱分离技术更加灵活多变而高效的分离模式:


 推出洗脱(Elution Extrusion CCC, EECCC)在完成一部分分离,即部分溶质被顺序洗脱后,以固定相代替流动相注入分离柱,分离柱中的固定相将被完全推出,其中存留的溶质仍然按照分配系数从小到大的顺序依次被推出,不但实现目标产物完全回收,还能够加快分离过程并减轻峰宽拖尾;


 反向洗脱(Back Extrusion CCC, BECCC)在完成一部分分离,即部分溶质被顺序洗脱后,固定相和流动相可以相互转换,分离柱中的固定相作为流动相以相反的方向被推出分离柱,其中存留的溶质按照分配系数从大到小的顺序,被依次从原入口洗脱;

       OptiChrome系列高速逆流色谱仪可实现模块化切换机芯改变仪器柱体积,方便用户实现不同制备量的实验;用户也可以通过串联或并联等方式以分离极性成分复杂的混合样品,或者根据样品量而改变双柱的连接方式等等。


  我们的分离柱连接方式对逆流色谱技术的应用拓展提供了可能,在同一台逆流色谱仪器上能够实现连续的不同溶剂系统的二维高速逆流色谱分离,提高逆流色谱的分离效率,还可以试验间歇双向逆流色谱等分离手段。

      高速逆流色谱技术(High Speed Counter Current Chromatography, HSCCC)是一种无固体载体的连续高效的液液分配色谱分离技术,采用多层缠绕的螺旋管柱,由柱体的高速行星式运动产生的不对称离心力场实现两相溶剂体系的高效混合、分配及充分保留,形成连续流萃取,从而实现不同溶解分配系数的溶质在两相溶剂中的高效分离。


  高速逆流色谱分离以液体为固定相,完全排除了溶质分子与固相载体之间相互作用而形成的各种复杂状况,如固体载体与样品发生化学反应而变性,以及不可逆吸附等所造成的回收率低、溶质色谱峰拖尾等现象,能够实现分离产物的基本完全回收,从而得到高纯度的馏分产物;而且对于生物活性分子的分离纯化而言,液体载体避免了固液吸附解吸相变、固液流变和压力剪切力对分子构象和活性的影响,使活性损失达到足够小。


  另外,液液分配分离相对固液分离而言,分离过程实际意义上并不是洗脱过程,而是对流穿透过程,溶质分子可以渗透至色谱柱内全部体积的固定相,而不是像固液分离中仅仅吸附于固定相的表面,因此固定相的样品容量大大提高,单次样品处理量可高数倍。同时由于节省了昂贵的固体填料消耗和溶剂消耗,能够大大降低分离纯化的实验成本,同时能减少有机试剂的环境污染。


  而且,以液体为固定相的分离过程意味着高速逆流色谱分离技术的灵活多变的分离模式。几乎任意两种不相溶的溶剂都能够被应用于液液分配分离当中;而不相溶的两相中任一相可以作为固定相在色谱柱中保留,利用同一个溶剂体系实现正相分离和反相分离。更有应用研究显示,在一个分离过程中固定相和流动相可以反复交替,实现连续流逆流色谱,产生更高的制备效率。[P Hewitson et al., Journal of Chromatography A, (2009)R. van den Heuvel, et al., J. Chromatogr. A (2009)]


       与同级别制备型高效液相层析相比,高速逆流色谱的优势包括:


        • 高回收率

        • 高制备量

        • 高纯度

        • 高活性保留

        • 低试剂消耗

        • 低分离成本

 

      这些优势都是当今生物科学和现代化药物研发对分离纯化技术提出的新需求,也是分离领域发展的必然趋势。目前,高速逆流色谱技术正在日益广泛地被应用于生物医药,化工,天然产物和食品工业等领域,尤其在天然产物行业中被认为是一种有效的不可替代的分离方法。


 

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